Микроскопия оптическая - совокупность методов наблюдения и исследования с помощью оптич. микроскопа.
Структуру любого объекта (препарата) можно различить,
если разные его частицы по-разному поглощают и отражают свет либо отличаются
одна от другой (или от среды) показателями преломления. Эти различия обусловливают
разницу амплитуд или фаз световых волн, прошедших через разные участки препарата,
от чего, в свою очередь, зависит контрастность изображения. В зависимости от
свойств изучаемого объекта и задач исследования существуют разл. методы наблюдения,
дающие несколько отличающиеся изображения объекта (рис. 1).
Метод светлого поля в проходящем свете (см. рис.
1 в ст. Микроскоп)наиб, распространён. Он используется для исследования
прозрачных объектов с включёнными в них абсорбирующими частицами и деталями.
Пучок света, проходя через непоглощающие зоны препарата, даёт равномерно освещённое
поле. Абсорбирующая частица на пути пучка света частично поглощает его, частично
рассеивает, вследствие чего амплитуда прошедшего через частицу света будет меньше
и частица выглядит на светлом фоне тёмным пятном (рис. 1, а). Контраст изображения
микроструктуры объекта тем больше, чем большим поглощением в видимой области
спектра обладает абсорбирующая частица. Биол. объекты, в большинстве своём не
обладающие этим свойством, предварительно окрашиваются спец. красителями.
Метод светлого поля в отражённом свете применяют
для наблюдения непрозрачных объектов, напр, шлифов металлов, сплавов, рудных
минералов. Структура препарата видна вследствие различия отражательной способности
его элементов. Препарат 1 (рис. 2) освещается через объектив 2 (выполняющий
одновременно роль конденсора) с помощью опак-иллюминатора, в к-ром устанавливается
полупрозрачная пластинка 3 или призма 4.
Метод тёмного поля в проходящем свете применяют
в биологии, гл. обр. для наблюдения прозрачных неабсорбирующих объектов, невидимых
при методе светлого поля, напр, бактерий. Пучок лучей (рис. 3), освещающих препарат
2, выходит из конденсора 1 спец. конструкции (конденсор тёмного
поля) в виде полого конуса и непосредственно в объектив 3 не попадает.
Изображение создаётся только светом, рассеянным элементами структуры препарата,
к-рые отличаются от окружающей среды показателем преломления. В поле зрения
микроскопа на тёмном фоне видны светлые изображения деталей (рис. 1, г). Этим
методом по виду изображения нельзя определить, прозрачны частицы или непрозрачны,
больший или меньший показатель преломления они имеют по сравнению с окружающей
средой.
Рис. 1. Микрофотографии живых клеток печени мыши,
полученные различными методами исследования: a - светлое поле; б - фазовый
контраст; в - интерференционный контраст; г - тёмное поле; а - флуоресценция
(окраска акридиновым оранжевым); е - поляризованный свет; т -
ультрафиолетовые лучи.
Метод ультрамикроскопии, основанный на том же
принципе (освещение препарата в ультрамикроскопах производится перпендикулярно
направлению наблюдения), даёт возможность при использовании ярких р1
источников света обнаруживать частицы, размеры к-рых лежат далеко за пределами
разрешения наиб, сильных микроскопов (до 0,002 мкм). При этом, однако, изображения
частиц имеют вид дифракц. точек, что не позволяет делать вывод об их истинной
форме.
Метод тёмного поля в отражённом свете (рис. 4)
осуществляется при освещении препарата 1 (напр., шлифа металла) сверху
с помощью зеркал 4 и спец. кольцевой зеркальной системы 3, расположенной
вокруг объектива и называемой эпиконденсором. Изображение 1' здесь создаётся
только лучами, рассеянными объектом (пунктирные линии).
Рис. 4. Метод тёмного поля в отражённом свете:
1 - препарат; 2 - объектив; 3 - эпи-конденсор; 4 -
кольцевое зеркало.
Рис. 5. Метод фазового контраста в проходящем
свете: 1 - апертур-ная диафрагма; 2
- конденсор; 3 - препарат; 4 -
объектив; 5 - фазовая пластинка; 6 - изображение.
Фазово-контрастная M. используется для наблюдения
прозрачных непоглощающих объектов, к-рые отличаются от окружающей среды показателями
преломления или толщиной. Вследствие этого различия световая волна, прошедшая
сквозь объект, претерпевает изменения по
фазе и приобретает т. н. фазовый рельеф. Фазовые изменения, не воспринимаемые
непосредственно глазом или фотопластинкой, с помощью спец. фазовой пластинки
(фазового кольца) переводят в амплитудные изменения (амплитудный рельеф), воспринимаемые
глазом как изменения интенсивности. Препарат 3 в фазово-контрастном микроскопе
(рис. 5) освещается через кольцевую апертурную
диафрагму 1, установленную в переднем фокусе конденсора 2. Изображение
её получается в заднем фокусе объектива 4, где помещается прозрачная
пластинка 5 с фазовым кольцом, размеры к-рого равны размерам изображения
диафрагмы. Фазовое кольцо представляет собой вытравленную в пластинке канавку
или нанесённую на неё тонкую плёнку.
Регулярный свет, прошедший через фазовое кольцо,
сдвигается по фазе на
(сплошные
линии), а свет, дифрагировавший на объекте, не попадает в кольцо и не
получает этого дополнит, сдвига по фазе (пунктирные линии). С учётом фазового
сдвига, внесённого самим объектом, разность фаз между регулярной и дифрагировавшей
волнами оказывается близкой к О или p, и эти волны интерферируют. В результате
в плоскости 6 формируется контрастное изображение объекта, в к-ром распределение
освещённости (рис. 1, б) приблизительно соответствует изменению показателя преломления
(или толщины объекта). При малой разности фаз в объекте регулярные и дифрагиров.
лучи сильно отличаются друг от друга по амплитуде. Поэтому для повышения контраста
на фазовое кольцо наносится дополнит, поглощающее покрытие.
Метод фазового контраста широко используется
при исследовании живых объектов, для к-рых окрашивание губительно. Он применяется
также в отражённом свете для изучения микронеровностей, загрязнений, нарушений
структуры на полиров, металлич. образцах.
Метод интерференционного контраста состоит в
том, что каждый луч, входящий в микроскоп, раздваивается: один проходит сквозь
наблюдаемую частицу, второй - мимо. В окулярной части микроскопа оба луча вновь
соединяются и интерферируют между собой. Результат интерференции определяется
разностью хода лучей 
к-рая выражается ф-лой 
где
- показатели преломления объекта и окружающей среды, d - толщина объекта,
N - порядок интерференции, 
-
длина волны.
Рис. 6. Метод интерференционного контраста: 1 - конденсор; 2 - среда, в которой находится объект 3; 4 -
объектив; 5 - компенсатор.
Принципиальная схема одного из способов осуществления
интерференц. контраста показана на рис. 6. Конденсор 1 и объектив 4 снабжены двоякопреломляющими пластинками (помечены на рис. диагональными
стрелками), первая из к-рых расщепляет исходный световой луч на два луча, а
вторая воссоединяет их. Один из лучей, проходя через объект 3, запаздывает
по фазе (приобретает разность хода по сравнению со вторым лучом, проходящим
только через среду 2); величина этого запаздывания измеряется компенсатором
5. Метод интерференц. контраста в нек-рых отношениях сходен с методом фазового
контраста: оба они основаны на интерференции лучей, прошедших через микрочастицу
и миновавших её. Отличие интерференц. метода от метода фазового контраста заключается
гл. обр. в возможности, используя компенсаторы, с высокой точностью (до
измерять разности хода, вносимые микрообъектом.
На основании этих измерений можно производить количеств, расчёты, напр, общей
массы и концентрации сухого вещества в клетках биол. препаратов. В интерференц.
микроскопах также отсутствуют ореолы, сопровождающие фазово-контрастное изображение;
такие микроскопы позволяют выявить участки объекта как с малыми, так и большими
градиентами показателя преломления или толщины (рис. 1, в). Однако эти микроскопы
существенно сложнее фазово-контрастных в производстве и эксплуатации. Принцип
интерференц. M. применим как к проходящему, так и к отражённому свету. На рис.
7 показана схема микроинтерферометра Линника, предназначенного для изучения
непрозрачных объектов. Свет от источника 7, пройдя коллиматор 2, разделяется
пластинкой 3 на два пучка равной интенсивности. Пучок сравнения фокусируется
объективом в на эталонном зеркале 7, а идентичный объектив S фокусирует
второй пучок на поверхности исследуемого объекта 9. После отражения от
зеркала и образца пучки возвращаются обратно по тем же путям, соединяются на
пластинке 3 и интерферируют в фокальной плоскости линзы 4, сопряжённой
с плоскостью объекта. Изображение предмета и интерференц.
картина расматриваются через окуляр 5.
Форма интерференц. полос, наблюдаемых на изображении
поверхности, повторяет профиль этой поверхности, что даёт возможность исследовать
её шероховатости, определять толщину плёнок, глубину канавок с погрешностью
0,01-0,02 мкм. Высота неровности определяется по ф-ле
где
- длина волны
света, b - ширина полос, а - величина их искривления при пересечении
измеряемой поверхности.
В методе дифференциального интерференц. контраста
(ДИК) обе волны проходят через один и тот же объект с небольшим боковым смещением.
Наиб, распространение получил вариант ДИК по Номарскому, в к-ром разделение
и сведение пучков производятся в поляризов. свете с помощью спец. двоякопреломляю-щих
призм, установленных соответственно перед конденсором и после объектива. Величина
разведения пучков выбирается близкой к разрешающей способности микроскопа, чтобы
не было заметно двоение изображения. Изображение в ДИК отражает градиент разности
оптич. пути в объекте в направлении раздвоения. Получаемое цветное изображение
рельефно; в нём, так же как и в предыдущем случае, отсутствуют ореолы. Благодаря
тому, что оба интерферирующих пучка проходят через одни и те же оптич. элементы,
устройства, реализующие ДИК, просты и удобны в обращении.
б
Рис. 8. Принципиальная оптическая схема поляризационного
микроскопа: a - для ортоскопического наблюдения; б - для коноскопического
наблюдения; 1 - поляризатор; 2, к - диафрагмы; 3 - конденсор;
4 - препарат; 5 - объектив; 7 - компенсатор; 8 - анализатор;
9 - линза Бертрана; 10 - фокальная плоскость окуляра; 11 -
окуляр.
Поляризационная M. используется для исследования
анизотропных объектов в поляризов. свете (проходящем и отражённом). У прозрачных
объектов во MH. случаях наблюдают интерференц. явления (см. Интерференция
поляризованных лучей), к-рые изучаются либо в параллельных лучах (ортоскопия),
либо в сходящихся лучах (коноскопия). При ортоскопич. ходе лучей (рис.
8, а)в фокальную плоскость окуляра 11 проецируется изображение
4' препарата 4. Наблюдаемая при этом интерференция поляризов.
лучей локализована в плоскости препарата. Пучок лучей, прошедших через поляризатор
1, ограничивается апертурной диафрагмой 2 конденсора 3; с помощью
поворотного анализатора 8 и компенсаторов разл. типов 7 производится
измерение величины двойного лучепреломления, углов поворота плоскости поляризации,
определение углов погасания и др. характеристик. При коноскопич. ходе лучей
(рис. 8, б)апертурная диафрагма 2 открывается, а наблюдение интерфоренц.
картины, локализованной в бесконечности, производится с помощью линзы Бертрана
9, к-рая проецирует выходной зрачок 6 в фокальную плоскость 10 окуляра. Получаемые при этом изображения дают возможность определить знак
двойного лучепреломления, кол-во осей объекта, их ориентацию и величину угла
между осями.
У непрозрачных объектов в поляризов. свете изучают
двуотражение и др. свойства. Наиб, распространение поляризац. M. получила в
минералогии, петрографии и кристаллографии, но применяется также для изучения
биол. объектов (рис. 1, е), в металлографии и т. д.
Люминесцентная (флуоресцентная) M. использует
явление фотолюминесценции (см. Люминесценция ),свойственное либо природе
самого микрообъекта (в большинстве случаев биологического), либо полученное
им после окраски спец. красителями - флуорохро-мами (вторичная люминесценция).
При этом наблюдается цветная контрастная картина свечения, позволяющая выявить
морфологич. и хим. особенности объектов (рис. 1, д). В люминесцентной
M. обычно используется флуоресценция, имеющая короткое время затухания. Схема
люминесцентного микроскопа отличается от схемы обычного микроскопа наличием
двух светофильтров: в осветит, системе и после объектива. Первый выделяет возбуждающее
излучение, а второй пропускает только свет флуоресценции.
Ультрафиолетовая и инфракрасная M. позволяют
проводить исследования за пределами видимой области спектра. Для визуализации
изображения используются электронно-оптич. преобразователи, телевизионные системы,
фотогр. устройства и др. УФ-М. (250-400 HM) применяется гл. обр. при исследовании
неокрашенных биол. клеток и ткаяей, к-рые обладают избират. поглощением в УФ-области
(рис. 1, ж). ИК-М. (0,75-1,2 мкм) позволяет изучать внутр. структуру
объектов, непрозрачных в видимом свете: нек-рых видов стёкол, кристаллов, минералов.
Рис. 9. Принципиальная схема стереомикроскопа
по схеме Грену.
Стереоскопическая M. позволяет видеть предмет
объёмным за счёт рассматривания его каждым глазом под разными углами. В стереомикроскопах
по схеме Грену (рис. 9) для этой цели служат две самостоят, оптич. системы,
образующие между собой угол 15°, что соответствует расстоянию конвергенции
250 мм. В одпообъектив-ных стереомикроскопах разные углы зрения для глаз образуются
за счёт использования периферич. зон выходного зрачка. В приборах этого типа
с помощью дополнит, оптич. системы возможно получение ступенчатого или
плавного изменения увеличения без замены объектива
и окуляров. Типичный диапазон увеличений в стерео-микроскопах от 4 до 100 крат
при рабочем расстоянии ок. 100 мм.
Контактная M. предназначена для прижизненного
исследования органов на клеточном уровне. Для этой цели разработаны спец. объективы
с нулевым рабочим расстоянием. Они приводятся в контакт с исследуемой тканью,
устраняют её микрорельеф и останавливают естеств. пульсации. Наблюдение проводится
в свете флуоресценции или тёмном поле при освещении препарата через объектив.
Телевизионная M. позволяет наблюдать микрообъекты
на телеэкране. Микроскопы этого типа могут быть построены на основе схемы с
передающей трубкой либо схемы с бегущим лучом. В телевизионных микроскопах с
передающей трубкой (рис. 10, а)препарат 3 освещается источником
света 1 через конденсор 2. Микрообъектив 4 и окуляр 5 создают действит. изображение препарата на фотослое передающей трубки 6, откуда изображение в виде электрич. сигналов передаётся через
Рис. 10. Блок-схема телевизионного микроскопа:
a - с передающей трубкой; б - с бегущим лучом.
электронную систему 7 на кинескоп 8, где
преобразуется в видимое изображение. Если препарат освещать последовательно
светом трёх длин волн или изображение одновременно проецировать на три передающие
трубки через блок цветоделения, то, передав сигналы с трубок на трёхцветный
кинескоп, можно получить на экране цветное изображение микрообъекта. В телевизионном
микроскопе с бегущим лучом (рис. 10, б)используется оптич. сканирование
препарата движущимся лучом света. В этом случае микроскоп, состоящий из объектива
3 и окуляра 2, работает в обратном ходе лучей и проецирует на
препарат 4 сильно уменьшенное изображение растра катодно-лучевой трубки
1, служащей источником света (источником света может быть и лазер с быстродействующим
сканирующим устройством). Приёмником света является фотоумножитель 6, установленный
под конденсором 5. При такой схеме точки препарата освещаются последовательно
по мере движения луча, а интенсивность прошедшего света пропорциональна пропусканию
той точки препарата, где находится бегущий луч. Выходной сигнал с фотоумножителя,
пропорциональный интенсивности прошедшего света, пройдя через электронную систему
7, управляет током электронного луча кинескопа 8. В результате на экране
кинескопа воспроизводится изображение препарата. Схемы с бегущим лучом дают
возможность наблюдать в течение длит, времени живые клетки в УФ-лучах, поскольку
на облучение каждой точки препарата затрачивается малая доля времени всего кадра.
Телевизионные микроскопы позволяют чисто электронным
путём менять масштаб, контраст и яркость изображения. Достоинством телевизионной
M. является возможность дистанционно наблюдать объекты (напр., радиоактивные).
Конфокальная M. реализует растровый способ построения
изображения (см. Растровые оптические системы ).При этом каждая точка
объекта последовательно освещается малым (дифракционно ограниченным) источником
излучения, а сигнал от неё детектируется с помощью точечного приёмника излучения.
Это позволяет увеличить разрешающую способность в 1,4 раза и получать
тонкие высококонтрастные оптич. срезы объекта, на основе к-рых можно восстанавливать
его объёмную структуру. Микроскопы этого типа могут быть построены на основе
схемы с лазерным сканированием и диафрагмой, установленной перед ФЭУ (конфокальный
лазерный сканирующий микроскоп), либо схемы с диском, в к-ром имеются наборы
сопряжённых диафрагм, расположенных в осветительной и окулярной частях прибора
(конфокальный микроскоп с тандемным сканированием).
Аналитическая M. включает в себя разл.
методы качеств, и количеств, определения состава вещества в отд. микроструктурах
размером от долей мкм до долей мм на основании исследования их оптич. характеристик
(см. Спектральный анализ ).Среди методов количеств, анализа под микроскопом
наиб, распространение получила цитофотометрия, позволяющая по поглощению определить
концентрацию или кол-во внутриклеточных веществ до 10-12-10-14
г.
Г. В. Папаян
|
|
 |
